瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的原理及方法

更新時間：2016-03-14 | 點擊率：2832

　　瓊脂糖凝膠結構均勻，含水量大(約占98%~99%)，近似自由電泳，樣品擴散較自由電流，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產生較強的電滲現象，加之硫酸根可與某些蛋白質作用而影響電泳速度及分離效果。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳。

　　瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進行電泳。瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。電泳后區帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。

　　瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內切核酸酶圖譜制作等。由于這種方法操作方便，設備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實驗方法之一。本文主要給大家說說，瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的原理及方法。

　　一、瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的原理

　　瓊脂糖凝膠電泳是用于分離、鑒定和提純DNA片段的標準方法。瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖，具親水性，但不帶電荷，是一種很好的電泳支持物。DNA在堿性條件下(pH8.0的緩沖液)帶負電荷，在電場中通過凝膠介質向正極移動，不同DNA分子片段由于分子和構型不同，在電場中的泳動速率液不同。溴化乙錠(EB)可嵌入DNA分子堿基對間形成熒光絡合物，經紫外線照射后，可分出不同的區帶，達到分離、鑒定分子量，篩選重組子的目的。

　　二、瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的方法

　　瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據它們的相對分子量質量及分子構型，同時與凝膠的濃度也有密切關系。

　　(1)核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關系

　　① DNA分子的大小在凝膠中，DNA片段遷移距離(遷移率)與堿基對的對數成反比，因此通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。但是當DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。

　　② 瓊脂脂糖的濃度。不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。

　　(2)核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關系

　　不同構型DNA的移動速度次序為：供價閉環DNA(covalently closed circular，cccDNA)>直線DNA>開環的雙鏈環狀DNA。當瓊脂糖濃度太高時，環狀DNA(一般為球形)不能進入膠中，相對遷移率為0(Rm=0)，而同等大小的直線雙鏈DNA(剛性棒狀)則可以長軸方向前進(Rm>0)，由此可見，這三種構型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時，也受到電流強度、緩沖液離子強度等的影響。

　　三、瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的實驗步驟

　　1、安裝電泳槽

　　將有機玻璃的電泳凝膠床洗凈，晾干，用膠帶將兩端的開口封好，放在水平的工作臺上，插上樣品梳。

　　2、瓊脂糖凝膠的制備

　　稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，(按0.3-1.5%的瓊脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝膠，20-100kb的DNA用0.5%的凝膠，200-2000bp的DNA用1.5%的凝膠)置微波爐或沸水浴中加熱至*溶化(不要加熱至沸騰)，取出搖勻。

　　3、灌膠

　　將冷卻到60℃的瓊脂糖溶液輕輕倒入電泳槽水平板上。

　　4、待瓊脂糖膠凝固后，在電泳槽內加入電泳緩沖液，然后拔出梳子。

　　5、加樣

　　將DNA樣品與加樣緩沖液按4：1混勻后，用微量移液器將混合液加到樣品槽中，每槽加10-20μl，記錄樣品的點樣次序和加樣量。

　　6、電泳

　　安裝好電極導線，點樣孔一端接負極，另一端接正極，打開電源，調電壓至3-5V/cm，電泳1-3hr，當溴酚藍移到距凝膠前沿1-2cm時，停止電泳。

　　7、染色和觀察

　　取出凝膠，放在含有溴化乙錠的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外燈下觀察，有橙紅色熒光條帶的位置，即為DNA條帶，或在紫外燈下照相記錄電泳圖譜。溴化乙錠是致癌劑，操作時要小心，必須戴手套。

　　四、實驗器具及藥品

　　電泳儀，電泳槽，紫外透射反射儀，恒溫水浴鍋，微波爐，微量進樣器，三羥甲基氨基甲烷，鹽酸，醋酸鈉，EDTA，瓊脂糖，溴酚藍，溴化乙錠。