活性氧檢測試劑盒是一種基于熒光染料DCFH-DA(2,7-Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate)的熒光強(qiáng)度變化，定量檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的常用方法。
下面讓我們來了解一下活性氧檢測試劑盒的操作過程吧
一、裝載探針
1、原位裝載探針(僅適用于貼壁細(xì)胞)
1)細(xì)胞準(zhǔn)備：檢測前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，確保檢測時細(xì)胞匯合度達(dá)到50~70%。
注：必須保證細(xì)胞狀態(tài)健康，且檢測時不會過度生長。
2) 藥物誘導(dǎo)：去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適量經(jīng)合適的緩沖液或無血清培養(yǎng)基稀釋到工作濃度的藥物，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，具體誘導(dǎo)時間根據(jù)藥物本身特性，以及細(xì)胞類型來決定。
陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等稀釋陽性對照(Rosup, 100 mM)到常用工作濃度100 μM，加入細(xì)胞，一般37℃避光孵育30 min-4 h可顯著看到活性氧水平提高，但依細(xì)胞類型會有比較明顯差異。(如，HeLa細(xì)胞孵育30 min;MRC5人胚胎成纖維細(xì)胞1.5 h;)
3)探針準(zhǔn)備：探針裝載前按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。
4) 探針裝載：吸除誘導(dǎo)用藥物，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA工作液。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜。例如;對于6孔板通常不少于1000 μL，對于96孔板通常不少于100 μL。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min。
5) 細(xì)胞清洗：用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1~2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。
2、收集細(xì)胞后裝載探針：適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。
1) 細(xì)胞準(zhǔn)備：按照標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)細(xì)胞，必須保證檢測用細(xì)胞狀態(tài)健康。按照適當(dāng)方法，清洗并收集足量的細(xì)胞。
2)藥物誘導(dǎo)：將收集好的細(xì)胞懸浮于適量稀釋好的藥物，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，具體誘導(dǎo)時間根據(jù)藥物本身特性，以及細(xì)胞類型來決定。(可選)陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等稀釋陽性對照(Rosup, 100 mM)到常用工作濃度100 μM，加入細(xì)胞，一般37℃避光孵育30 min-4 h可顯著看到活性氧水平提高，但依細(xì)胞類型會有比較明顯差異。【如，HeLa細(xì)胞孵育30 min;MRC5人胚胎成纖維細(xì)胞1.5 h;】
3) 探針準(zhǔn)備：探針裝載前，按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。
4) 探針裝載：去除細(xì)胞內(nèi)藥物，離心收集細(xì)胞，加入適當(dāng)稀釋好的探針，使其細(xì)胞密度為1.0×106~2.0×107。
注：細(xì)胞密度需根據(jù)后續(xù)的檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來進(jìn)行調(diào)整。如，對于流式分析，單管檢測內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不少于104，也不可多于106。每隔3-5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。
5)細(xì)胞清洗：用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1~2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。
二、檢測
原位裝載探針法：激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測。
收集細(xì)胞后裝載探針：用熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。
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